1) 심사를 신청하는 LMM의 명칭, 생산공정이용의 배경과 신규 도입유전자 산물의 사용 목적, 산업적 필요성, 장점 등에 대해 기술

1) 생산공정에서 LMM의 주요 용도 및 역할에 대해 기술

• 1) LMM의 사용이 승인된 국가와 용도를 기술하고 관련 정보 제시
  • ㅇ LMM이 승인된 국가와 용도를 기술하고 해당 국가에서 발행한 인증 문서 등 관련 정보를 제시(예. 위해성심사 결과통보서, 승인서 등)
  • ㅇ LMM이 승인된 국가가 없는 경우, “현재까지 사용이 승인된 국가 및 사례 없음”으로 표기하고 동일 또는 유사 제품을 생산하는 공정에서 LMM을 이용한 국내외 선례가 있는지 기술

• 1) 계통학적 분류명
  • ㅇ 학명: 속명 및 종소명, 가능한 경우 균주명
• 2) 유래(Source)와 그 근거가 되는 정보
  • ㅇ 분양 또는 구매한 경우,
    • ∙ 기관명, 등록번호와 그 근거가 되는 정보 제시 (예. 분양 확인서)
    • ∙ 분양 또는 구매 기관에서 제공하는 균주 특성에 관한 구체적 정보 제시
  • ㅇ 그 외의 경우, 분리·동정의 근거가 되는 정보
    • ∙ 학명이 공인된 종과의 유사점, 차이점과 그 근거가 되는 정보
    • ∙ 균주를 분리한 환경, 장소에 관해 설명하고 확립된 기준 주의 보존기관과 등록번호 등 관련 정보 제시
  • ㅇ LMM이 4. 유전자변형특성에 관한 자료와 5. 유전자변형미생물에 대한 자료에 기술된 내용 이외의 염기서열변화 또는 생리적 특성을 가지도록 선발된 경우 이와 관련된 내용을 기술
    • ∙ 유전적 변형(도입, 치환, 결실, 삭제 등)의 이유와 방법
    • ∙ 서열 삭제의 경우, 삭제 부위의 크기와 기능 기재
    • ∙ 학술 문헌에 기재된 경우, 주요 내용을 요약한 후 명칭과 참고문헌을 기재하여 제출
• 3) 유전체 서열(Genome sequence)이 보고된 경우, 관련 정보(예. 데이터베이스, 등록번호 등) 제시
• 4) 분류학적 특성
  • ㅇ 생육, 생장 특성
    • ∙ 유성 또는 무성 생식 주기(포자형성 능력 포함)
    • ∙ 증식온도와 속도, 영양요구성, 산소요구성, 약제 감수성 등의 특성 기재

• 1) 숙주가 생산공정에 이용된 역사 및 사례를 제시
  • ㅇ 숙주가 이용된 역사 및 최신 자료를 포함한 사례 제시

• * 독소 생산성, 알레르기 유발성, 유해 생리활성물질 생성 및 항생제 내성, 항생물질 생성과 관련된 숙주와 근연종의 유전자형과 표현형에 관해 설명하고 관련 정보 제시
• 1) 유전자형과 표현형에 관한 정보가 있는 경우
  • ㅇ 현재까지 문헌에 보고된 자료를 중심으로 정리한 자료
  • ㅇ 검색 데이터베이스를 이용한 경우는 데이터베이스 명칭, 버전, 검색 일자, 분석조건 제시
• 2) 유전자형과 표현형에 관한 정보가 없는 경우
  • ㅇ 차세대염기서열분석법을 이용한 전장염기서열분석 결과 제시
    • ∙ 염기서열의 분석 방법 및 조건 등을 결과와 함께 상세 기술
    • ∙ 유전자정보 등은 데이터베이스를 통해 제시할 수 있음

• 1) 인체질환과의 연관성을 바탕으로 기술하고 생물안전등급(Biosafety level, 이하 BSL) 또는 생물학적 위험군(Risk group) 관련 정보 제시
  • ㅇ 분양 또는 구매하여 관련 정보가‘가-2)’에 설명된 경우, 해당 부분(페이지 표기) 참조로 표기하여도 무방함
    • ∙ 유전자재조합실험지침(보건복지부 고시)‘위험군별 해당 생물체 목록(생물체의 위험군 분류)’ 참조
• 2) 현재까지 알려진 병원성이 없고 병원체와 관련성이 없는 경우, 근거가 되는 문헌 자료, 데이터베이스 등을 제시하고 “현재까지 알려진 병원성 없음”으로 기술

• * 도입유전자의 공여체 모두를 기재하되, 아래 1), 2), 3)에 관련 내용을 기술하고 자료를 제시할 것
• * 도입유전자의 서열이 인위적으로 변경되었거나 두 종 이상의 다른 공여체 유래의 융합유전자 또는 합성유전자가 사용되는 경우, 도입유전자의 변경에 관한 사항을 제시하고 원형 유전자 또는 단백질 수준에서 가장 유사도가 높은 유전자를 기준으로 공여체에 관하여 기술하고 관련 자료 제시
• ㅇ 다음과 같이 요양정리 후 모든 공여체에 대한 상세 기술
• 
  
• ※ 획득 방법의 예: '공여체를 이용한 클로닝', '합성(코돈최적화 포함)'등
• ※ 공여체가 둘 이상이면 연번으로 구분하고 각각의 공여체에 관한 정보 기술
• 1) 계통학적 분류명
  • ㅇ 학명: 속명 및 종소명
• 2) 유래와 그 근거가 되는 정보
  • ㅇ 분양 또는 구매한 경우
    • ∙ 기관명, 등록번호와 그 근거가 되는 정보 (예. 분양 확인서)
    • ∙ 분양 또는 구매 기관에서 제공하는 균주 특성에 관한 구체적 정보 제시(예. 숙주의 유전자변형 여부, 데이터베이스, 기타 근연종과의 차이점)
  • ㅇ 그 외의 경우, 동정 근거가 되는 정보
    • ∙ 학명이 공인된 종과의 유사점, 차이점과 그 근거가 되는 정보
    • ∙ 균주를 분리한 환경, 장소에 관해 설명하고 확립된 기준 균주의 보존기관과 등록번호 등 관련 정보 제시
  • ㅇ 합성한 경우, 3)항으로 대체 가능
• 3) 유전체 서열(Genome sequence)이 보고된 경우, 관련 정보(데이터베이스, 등록번호 등) 제시 및 코돈 최적화 수행 여부
• 4) 분류학적 특성
  • ㅇ 공여체 또는 근연종의 생육, 생장 특성
    • ∙ 유성 또는 무성 생식 주기(포자형성 능력 포함)
    • ∙ 증식온도와 속도, 영양요구성, 약제 감수성, 산소요구성 등의 특성

• ㅇ 공여체의 도입유전자가 산업적으로 이용된 역사와 사례 제시
• ㅇ 공여체의 도입유전자 이외의 다른 유전자가 산업적으로 이용된 역사 및 사례 제시

• * 독소 생산성, 알레르기 유발성, 유해 생리활성물질 생성 및 항생제 내성, 항생물질 생성과 관련된 공여체의 유전자형과 표현형에 관해 설명하고 관련 정보 제시
• ㅇ 현재까지 문헌에 보고된 자료를 중심으로 정리한 자료 제시
• ㅇ 유전자형과 표현형에 관한 문헌이 없는 경우, 도입유전자, 융합유전자에 대해 관련 유전자 데이터베이스 분석 결과를 데이터베이스 명칭, 버전, 검색 일자, 분석조건과 함께 제시
• ㅇ 독소 생산성, 알레르기 유발성 및 기타 유해 생리활성물질 생산성과 관련이 없는 경우, “현재까지 알려진 독소 생산성, 알레르기 유발성 및 기타 유해 생리활성물질 생산성 없음”으로 표기

• ㅇ 공여체의 생물안전등급(BSL) 또는 위험군(Risk group) 관련 정보 제시
• ㅇ 인체질환, 병원성에 관련된 유전자형과 표현형에 관해 작성하고 관련 정보를 제시
• ㅇ 병원성 존재 및 알려진 병원체와의 관련성이 없는 경우, 관련 문헌 자료, 정보 등을 제시하고 “현재까지 알려진 병원성 없음”으로 표기

• (1) 명칭, 기능 및 유래된 생물체
  • 1) 벡터의 명칭
    • ㅇ 벡터(제작과정에 사용된 모든 핵산 물질)의 명칭 기재
  • 2) 기능
    • ㅇ LMM 내 또는 유전자변형 과정에서 존재하는 벡터의 기능을 기재
  • 3) 유래 생물체
    • ㅇ 벡터가 유래된 생명체, 기원에 대해 기술
  • 4) 벡터가 산업적으로 이용된 사례
• (2) 구성요소 및 도입유전자를 포함한 지도
  • 1) 벡터 기원과 구성요소
    • ㅇ 벡터의 기원과 유형(플라스미드, 파지, 바이러스, 트랜스포존, 합성유전자 등)에 대한 정보 제시
    • ㅇ 상용 벡터가 골격으로 사용된 경우, 제품번호와 그 근거가 되는 정보 제시
    • ㅇ 벡터의 구성요소를 표로 정리하고 설명 제시
      • ∙ 벡터 구성요소들의 특성, 유래(기원), 기능, 크기, 염기서열 정보 제공
      • ∙ 전사개시인자, 종결인자 및 기타 벡터의 기능 및 유전자변형과정에 영향을 주는 인자 등을 포함할 것
      • 
        
    • ㅇ 발현 조절을 위한 DNA 서열을 포함한 경우, 또는 정제의 편이성이나 발현 산물의 세포 내외 위치를 지정하기 위해 tag를 포함한 융합단백질(Fusion protein)을 만드는 경우, 관련 요소들을 모두 포함할 것
  • 2) 발현 벡터 지도
    • ㅇ 완성된 최종 발현 벡터 지도 제시
      • ∙ 공여 핵산 서열이 삽입된 최종 재조합 벡터 맵을 제시하고, 대체 또는 변형된 서열의 위치와 방향성을 자세히 기술
      • ∙ 제한효소 절단 지도 제시
      • ∙ 벡터 내 신규전사해독프레임 정보 제시
• (3) 병원성 독소 등 위해 염기서열의 존재 여부
  • ㅇ 유전자 데이터베이스를 이용하여 기존에 알려진 유해 단백질 아미노산 서열과 상동성 여부를 검토하고 사용된 데이터베이스 분석 결과와 데이터베이스 명칭, 버전, 검색 일자, 분석조건 제시
    • ∙ 사용한 데이터베이스 종류(버전, 연도, local과 global alignment 중 사용하는 분석방법), 기본 검색조건(서열 비교에 사용된 substitution matrix (예: BLOSUM62, gap penalty 값, e-value 숫자 등) 등과 함께 e-value 설정의 근거가 제시되어야 함
    • ∙ 전체 데이터베이스를 대상으로 단백질 서열 비교가 가능한 BLAST를 수행하거나 문헌 등으로 뒷받침되는 데이터베이스를 활용할 것
    • ∙ 유해하거나 유해 가능성이 있는 단백질이 최종 생산물에 포함될 가능성 유무 기술
• (4) 다른 생물체로의 전달 가능성 및 숙주 범위
  • 1) 벡터가 숙주 생물 외의 다른 생물체로 스스로 전달(이동)하는 성질
    • ㅇ 현재까지 보고된 문헌 자료(벡터 및 Origin sequence)를 기반으로 형질전환(transformation), 형질도입(transduction), 접합(conjugation) 등의 가능성을 설명
    • ㅇ 데이터베이스 검색을 이용할 경우, 결과와 탐색기준 제시: 데이터베이스 명칭, 버전, 검색 일자, 분석조건도 함께 기술
• (5) 선발표지유전자
  • 1) 유전자가 삽입된 숙주의 선발을 위하여 사용된 선발표지유전자에 대한 설명 제시
  • 2) 유전자변형생물체법 통합고시 별표 2-2에 따른 국가 승인 제외대상 약제내성 유전자에 해당하는지를 기술
  • 3) 선발표지유전자를 제거한 경우, 해당 과정과 제거 여부를 확인할 수 있는 자료 제시
    • ㅇ 예: 서던 블롯, 실시간 PCR, 또는 전장염기서열분석법 사용

• ※ 본 항에서 도입유전자는 도입된 신규 유전자를 포함한 완성된 벡터 또는 선형화된 유전자 발현카세트를 지칭하는 것으로, 발현 산물(단백질)에 관한 내용을 중심으로 기술함
• (1) 도입유전자의 기능 및 특성
  • ㅇ 발현 조절을 위한 DNA 염기서열이 포함된 경우, 또는 정제 편이성이나 발현 산물의 세포 내외 위치를 지정하기 위해 tag를 포함해 융합단백질을 만드는 경우, 관련 요소들을 모두 포함하여 기술
  • ㅇ 변형(삽입, 외부 유전자도입, 기존 유전자 삽입, 결손, 코돈최적화 등)된 유전자에 대한 정보
  • (가) 병원성, 독성 등 위해 발현 가능성
    • ㅇ 도입유전자와 벡터 및 인접하는 숙주 게놈 유전자 서열의 신규전사해독프레임 유무와 그 전사 및 발현 가능성
      • ∙ 목적하는 발현 단백질 해독 프레임 이외의 신규전사해독프레임 유무를 확인하고 존재할 경우, 위해 발현 가능 여부를 기술
        - 신규전사해독프레임이 존재하는 경우, 관련 유전자 산물을 기존 유해물질(독소, 알레르겐, 기타 성분 등)과 각각 비교한 자료 또는 분석 결과(아래 ‘나’항의 방법 이용)를 제시
  • (나) 독소생산성 및 독력, 생산 독소의 생물학적 및 생화학적 특성
    • ㅇ 도입유전자 발현 단백질의 아미노산 독소 상동성 비교 결과 제시
      • ∙ 서열 유사성을 바탕으로 한 발현 유전자의 독소 상동성 검색 결과 제시
      • ∙ 사용한 데이터베이스 종류(버전, 연도, local과 global alignment 중 사용하는 분석방법), 기본 검색조건(서열 비교에 사용된 substitution matrix (예: BLOSUM62, gap penalty 값, e-value 숫자 등) 등과 함께 e-value 설정의 근거가 제시되어야 함
      • ∙ 신청하는 LMM의 숙주 독소를 포함하는 데이터베이스를 사용할 것(예: 미세조류의 경우 미세조류의 독소를 포함하는 데이터베이스)
      • ∙ 단백질 전체 아미노산 서열이 50% 이상의 유사성(similarity) 또는 범위율(coverage)과30% 이상의 상동성(identity)을 갖는지 여부
    • ㅇ 도입유전자 발현 단백질의 알레르겐 상동성 검색
      • ∙ 이미 알려진 알레르겐의 아미노산 서열과의 구조적 유사성 비교
        • - FASTA 또는 BLASTP 등 다양한 알고리즘 분석을 통해 구조적 유사성을 확인한 결과를 제시
          : 유전자 산물의 80개 이상의 아미노산 부분에서 이미 알레르겐으로 알려진 단백질의 아미노산과 35% 이상의 상동성을 갖는지 여부
      • ∙ 아미노산 서열 분석을 실시하여 직선 에피토프(epitope)를 나타낼 가능성이 있는 서열을 확인한 자료를 제시
        : 유전자 산물의 연속된 8개 이상의 아미노산이 이미 알레르겐으로 알려진 단백질에 존재하는지 확인
      • ∙ 사용한 데이터베이스 종류(버전, 연도), 기본 검색조건(조건을 설정한 근거)의 gap penalty 값, e-value 숫자 등) 등도 제시되어야 함
    • ㅇ 신규전사해독프레임이 존재하여 발현 산물이 독성 또는 알레르겐 가능 물질로 예상되는 경우, 아래의 분석 결과 제시
      • - 발현 단백질 특성(아미노산 서열, 크기, 활성 등)
      • - 생물학적 및 생화학적 특성 분석: 기존 보고된 문헌 자료를 토대로 설명하거나 실험 결과 제시
      • - 위해 가능성을 가진 단백질이 최종 생산물에 포함될 가능성 유무 기술
  • (다) 약제내성 발현성 및 교차내성 등 특성
    • 1) 도입유전자 발현 단백질의 항생제내성(또는 항생물질 생성과 관련된) 단백질과의 서열 상동성 검색 결과 제시
      • ㅇ 인간과 동물의 치료목적으로 사용되는 항균제(Critically 또는 Highly Important Antibiotics, CIAs 또는 HIAs) 대상
        • ∙ 사용된 데이터베이스(버전, 연도), 프로그램, 분석조건, 신규전사해독프레임 존재 여부와 전사 및 발현 가능성, 단백질의 특성 등 제시
        • ∙ 단백질 전체 아미노산 서열이 global alignment의 경우 50% 이상의 유사성(similarity)과 30% 이상의 상동성(identity), local alignment의 경우 50% 이상의 범위율(coverage)과 30% 이상의 상동성(identity)을 갖는지 여부
    • 2) 새롭게 도입한 항생제내성 유전자가 있는 경우, 교차내성 발현이 예상되는 항생제의 최소억제농도(MIC) 값을 숙주의 MIC 범위 이내에 위치하는지 제시
      ㅇ 5-사-2)와 연계하여 평가 가능
  • (라) 병원성 및 병독성 감염대상 범위의 변이성 등 생물학적 특성
    ㅇ ‘상기 (가)~(다) 내용과 같음’으로 표기
    • 1) 도입유전자 발현 단백질의 항생제내성(또는 항생물질 생성과 관련된) 단백질과의 서열 상동성 검색 결과 제시
• (2) 도입유전자의 크기 명칭 및 염기서열 (위해 염기서열의 존재 여부 포함)
  • 1) 도입유전자 크기, 명칭, 염기서열, 아미노산 서열, 기능, 유래, 관련 데이터베이스 등록번호 등을 표로 제시
  • 
    
  • 2) 도입유전자 산물의 확인
    • ㅇ 도입유전자 발현 산물의 확인 (예. SDS-PAGE 등)
• (3) 조절인자 및 유전자 기능에 영향을 주는 기타 인자
  • ㅇ 전사개시인자, 종결인자 등 조절인자 및 유전자 기능에 영향을 주는 여타 인자들의 위치, 서열 및 기능에 관한 정보와 설명 제시

• * 유전자변형 과정 전반에 대해 순서대로 자세히 기술함
• 1) 형질전환에 사용된 기술(방법) 및 세부 과정 등을 설명하고 단계별로 확인할 수 있는 결과 제시
  • ㅇ 관련하여 그림과 표를 제시할 수 있음
  • ㅇ 보조 플라스미드, carrier DNA 등 사용된 핵산에 관한 내용도 포함할 것
• 2) 중간숙주 사용 여부 및 사용된 유전자를 최종 LMM에서 제거한 방법 기술
  • ㅇ 도입유전자는 ‘4. 나’에 상세 기술 후 인용하고 다른 항에서 기술된 내용을 요약 정리하여 간략히 설명
  • ㅇ 최종적으로 사용된 플라스미드의 제조과정에 대한 정보 제시
    • ∙ 유전자를 삭제한 경우, 삭제된 부위의 크기와 기능을 제공할 것
    • ∙ 보조 플라스미드를 사용한 경우, 이를 포함해 차례대로 최종 재조합 벡터를 제작하는 과정을 설명하고 도식화하여 제시
• 3) LMM 선별 과정에 대한 방법 상세와 결과 제시

• 1) LMM 명칭
• 2) 기탁한 경우, 이를 확인할 수 있는 관련 정보, 문서 제시
  • ㅇ 기관명, 기탁번호, 기탁 일자 등

• 1) 도입유전자 발현 산물의 성질 및 기능
• 2) 도입유전자 발현 산물에 의해 숙주와 비교하여 새롭게 획득된 성질에 관해 기술
  • 가) 의도적으로 LMM이 획득한 새로운 특성, 기능에 대해 기재
  • 나) 비의도적으로 LMM이 획득한 새로운 특성, 기능에 대해 기재

• ※ 다음 시험 항목에 대해 숙주와 LMM을 3회 반복 실험하여 통계처리한 결과를 설명과 함께 제시
• 1) 생존 및 증식 능력 비교
  • ㅇ 유도기, 대수 증식기, 정체기, 사멸기까지 적절한 간격의 시간대별로 실험수행
    • ∙ 식품공전에 따른 식품의 기준 및 규격 등을 참조하여 최소배지와 생산공정이용 실제 배지를 이용하여 실험할 것
    • ∙ 배양공정 중 발현유도체, 영양분 등을 추가하는 경우, 투입 시점 등 방법을 명기할 것
• 2) 항생제 감수성 비교
  • ㅇ Critically Important Antimicrobials(CIAs) (6th revision 2018, WHO) 및 아래의 국제적으로 인정되는 표준검사법을 참고하여 시행한 결과 제시
    • ∙ Clinical & Laboratory Standards Institute(CLSI) M02-A12 (Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests; Approved Standard)
    • ∙ CLSI M07-A10 (Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests)
    • ∙ ISO20776-1 (Susceptibility testing of infectious agents and evaluation of performance of antimicrobial susceptibility test devices)
    • ∙ 개발 시 사용한 항생제는 필수 포함하고 3회 반복 실험한 결과 제시
  • ㅇ 진균류의 경우, 항생제내성 관련 유전자 데이터베이스 분석 결과 제시
    • ∙ 사용된 데이터베이스(버전, 연도), 프로그램, 분석조건 등 제시
• 3) 생물학적 불활성화(사멸화) 비교
  • ㅇ 비변형 (유전자재조합기술을 이용한 유전적 변형이 없는 야생형) 숙주와 LMM의 물리적, 화학적 방법 등을 사용한 불활성화(사멸화) 비교 자료 제시
    • ∙ 실제 생산공정과 동일한 조건 또는 대량배양(10리터 이상)/파일럿스케일 조건에서 3회 반복 실험한 결과를 제시
  • ㅇ 포자형성이 알려진 종의 경우, 포자형성 능력과 불활성화(사멸화) 후 재발아 여부를 확인한 자료 제시

• ㅇ LMM의 피부감작성 비교시험 결과 제시
  • ∙ 음성과 양성대조군의 시험결과가 포함되어야 하고 신뢰할 수 있는 외부 공인기관에 의뢰하여 수행 (예. 식약처에서 인정한 비임상시험실시기관)
  • ∙ 공인기관이 아닌 경우, 통합고시 제4-3조 제2항 제3호에 따른 결과보고서 제출

• 1) 도입유전자 위치
  • ㅇ 플라스미드에 위치한 경우, 해당 위치를 기술하고 확인한 실험방법과 결과 제시
    • ∙ Sanger 염기서열분석자료, 전장염기서열분석자료 등을 제출할 수 있음
  • ㅇ 숙주 유전체에 위치한 경우
    • ∙ 서던 블롯, 전장염기서열분석자료 등을 제출할 수 있음
  • <유전체 정보가 알려진 경우>
    • ∙ 숙주 분양기관의 추적정보와 NCBI 등 데이터베이스 상의 서열정보 제시
    • ∙ 삽입 위치(숙주 기준 좌표)
    • ∙ 삽입으로 인한 영향
      • - 숙주 게놈 유전자 염기서열의 결실 및 의도하지 않은 추가 서열의 삽입 여부
      • - 의도하지 않은 신규전사해독프레임 생성 여부를 확인한 자료와 설명 제시
        • : 숙주에 없는 신규전사해독프레임이 만들어지는 경우, 아미노산 서열상 유사한 단백질의 정보 제시
  • <유전체 정보가 알려지지 않은 경우>
    • ∙ 삽입 위치
    • ∙ 도입유전자 삽입 위치 주변 (양쪽 각각 최소 500 bp) 서열정보 제시
    • ∙ 삽입으로 인한 영향
      • - 숙주 게놈 유전자 염기서열의 결실 및 의도하지 않은 추가 서열의 삽입 여부
      • - 의도하지 않은 신규전사해독프레임 생성 여부를 확인한 자료와 설명 제시
        • : 숙주에 없는 신규전사해독프레임이 만들어지는 경우, 아미노산 서열상 유사한 단백질의 정보 제시
• 2) 도입유전자의 복제 수
  • ㅇ 도입유전자의 복제 수를 기술하고 확인한 실험방법과 결과 제시
    • ∙ Real-time PCR을 이용한 경우, 숙주와 최종적으로 사용된 플라스미드 DNA를 대조군으로 이용
      • - 농도를 알고 있는 양성대조군과의 비교를 통해 계산된 플라스미드 복제 수를 제시
    • ∙ 서던 블롯의 경우, 최소한 두 개 이상의 제한효소를 사용하여 위치 확인 결과와 함께 도입유전자의 복제 수를 양성대조군(단일 복제 수의 숙주유전자 등)을 이용해 정량적으로 검증한 결과 제시
    • ∙ 전장염기서열분석자료를 제출할 경우, in silico 결론과 함께 분석 방법 및 기준을 상세히 제시
      • - 접합부 서열을 검출할 수 있을 정도로 충분한 길이로 분석
• 3) 도입유전자의 안정성(구조 유지와 전이 여부) 확인
  • ㅇ 총 생산공정에 필요한 시간의 2배 기간까지 생산공정이용 배지를 사용하여 도입유전자의 위치와 복제 수를 확인한 결과 제시
    • ∙ 배양 시작 시점(또는 종균배양 완료 샘플), 생산공정 중 본배양 완료 샘플, 생산공정에 필요한 시간의 2배 동안 배양한 샘플에 대한 데이터 제시
      • - 배양 시작 시점(또는 종균배양 완료 샘플)의 도입유전자 위치 및 복제 수에 대한 자료는 위의 도입유전자의 위치 및 복제 수 확인 내용을 사용할 수 있음
  • ㅇ 도입유전자가 플라스미드에 위치하는 경우, 숙주 유전체로의 비의도적 삽입이 없음을 확인한 자료와 설명 제시
    • ∙ Real-time PCR법을 이용할 경우, 재조합벡터와 도입유전자가 제거된 LMM의 DNA를 이용하여 숙주 유전체 상의 단일 복제 수의 유전자가 검출 가능한 수준으로 실험하며 양성대조군, 음성대조군, 샘플, 반응조건, 검출한계(Limit of detection, LOD) 등 재료와 실험방법을 상세 제시
  • ㅇ 전장염기서열분석자료를 제출할 경우, 도입유전자 및 인접서열 분석에 사용한 방법에 대해 제시

• ※ 앞 5.마 항의 가이드 내용을 참조하여 기술
• ㅇ 숙주 내 벡터의 존재 여부를 기술하고 master stock에서 확인한 자료는 다음 ‘사’항에서 제시할 것

• ※ 위‘마’와 ‘바’항에서 제시한 방법을 이용하여 최종 제품에서 LMM, 도입유전자와 벡터를 확인하는 방법 및 확인 결과를 제시: 중복 내용은 인용 가능, 제시한 EFSA 가이드라인 참고
• 1) 유전자기반의 LMM과 도입유전자 확인 방법과 결과 제시
  • ㅇ 서던 블롯, PCR, 전장염기서열분석자료 등을 제출할 수 있음
    • ∙ DNA 추출 실험방법의 적정성(회수율) 확인을 위해 일정 부피 또는 질량의 생산용 배지, 균체와 제품에 LMM의 총 DNA(도입유전자를 포함한 genomic DNA 또는 플라스미드)를 다양한 농도로 첨가한 후 DNA를 추출하여 추출한계를 제시
    • ∙ 양성 및 음성대조군을 이용할 것
      • - 양성대조군
        • ① LMM의 총 DNA만 사용한 샘플
        • ② PCR 반응 저해물질 혼입 여부 확인을 위해 균체 또는 제품에서 추출한 DNA에 알려진 농도의 LMM의 총 DNA를 추가하여 주형으로 이용한 PCR 반응 포함
      • - 음성대조군: 기본적으로 숙주 총 DNA를 사용하되 필요한 경우, 물 사용 가능
    • ∙ PCR 반응의 경우, 실험재료, 방법, 조건 등을 명확히 제시
      • - 사이클 수 포함한 PCR 반응의 조건, 사용 DNA의 농도
      • - PCR 반응의 검출한계(Limit of detection, LOD)를 함께 제시
  • ㅇ 숙주 내 벡터의 존재 여부를 기술하고 Master Cell Stock에서 확인한 자료 제시
    • ∙ Master Cell Stock에서 벡터 존재 여부를 확인한 자료를 제시
    • ∙ 벡터를 제거한 경우 관련 실험방법과 결과 제시
    • ∙ PCR 분석 결과를 제시할 경우: 양성대조군, 음성대조군, 샘플, 반응조건, 검출한계(Limit of detection, LOD) 등 재료 및 방법에 대해 상세히 기술
    • ∙ 전장염기서열분석자료를 제출할 경우, 전장염기서열 생산 플랫폼 정보와 FASTQ 또는 이에 상응하는 형식으로, 압축(예: gzip) 또는 비압축, Paired end 또는 Single end로 제출(Assembled sequences는 FASTA 형식(예:*.fasta)으로 제출 가능)
• 2) 공정 최종 산물에서의 LMM 혼입 부정 확인 결과 제시

• 1) LMM 생산공정이용 방법
  • ㅇ 전체 공정을 설명하고 공정흐름도(Process Flow Diagram, 이하 PFD) 제시
    • ∙ 종균배양 > 본배양 > 분리 > 정제 > 열처리 > 폐액·폐기물 저장조 > 폐기물 배출, 이동 등 차례로 제시
    • ∙ PFD는 전체 공정흐름을 도식화하여 명료하게 표시
      • - PFD에 각 단위공정의 주요 운전조건(온도, 시간, 압력 등) 제시
        예) 사멸공정이 진행되는 장비는 사멸조건을 PFD에 간략히 표시
      • - LMM 검출(모니터링, 부정확인) 포인트 표시
      • - LMM 이동 경로는 생균 상태와 사균 상태를 구분하고 작업자의 동선과 구별하여 표기
• 2) LMM 모니터링 시행 계획 및 방법
  • 가) 검출 방법
    • ㅇ 모니터링 시행 계획 및 방법에 대해 설명하고 관련 정보를 제시
      • ∙ 모니터링 지점, 시행 횟수, 관리운영 사항에 대해 설명
      • ∙ LMM 부정확인시험 방법은 선택배양법과 유전자기반 방법을 단계별로 기술
    • ㅇ 관련 문서의 대표 이미지를 본문에 삽입하고 해당 문서는 별첨

• 1) 시설 위치, 규모, 구성에 관한 설명 제시
  • ㅇ 눈으로 확인할 수 있는 해상도의 시설 전체 도면 제시
  • ㅇ LMM 작업구역과 일반구역으로 구분하여 설명
    • ∙ 공정 순서에 따라 하고 표로 요약하고 관련 설명과 정보 제시
    • ∙ 시험시설(공정검사, In process control)을 표기하고 설명 제시
• 2) 장비 배치도, 배양기 등 LMM 취급과 관련된 밀폐시스템, 배관 및 계장도(Piping and instrumentation diagram, 이하 P&ID) 제시하고 P&ID 상에 장비의 Waste line 정보 상세 표기
  • ㅇ 공정 순서에 따라 이용되는 장비별로 번호를 표기하고 그림 하단에 레이블로 표시
    • ∙ 번호, 장비명, 설치 사진, 용도 및 기능, 수량, 규격 등 상세
• 3) 밀폐시스템의 밀폐 검증
  • ㅇ 밀폐시스템의 밀폐성을 검증하는 방법 및 시험 주기 명시(예: 발효기, 배관 누기시험(Leakage test), 압력지지 시험(Pressure hold test) 등)
  • ㅇ 검증 주기를 포함한 운영사항을 기술하고 관련 문서를 제시
  • ㅇ 다른 LMM 또는 여타 생물체를 함께 이용하는 시설인 경우, 밀폐확보와 교차오염 방지와 관리에 관한 설명 제시

• 1) 안전관리 수칙
  • ㅇ 통합고시 별표 4-3「생산공정이용시설 설치 및 운영기준」에 따른 시설 등급별 운영기준을 참조하여 안전관리 수칙 및 자체 점검 방안(책임자, 점검 방법, 횟수, 기록 관리 등)에 관해 작성
• 2) 응급조치 사항
  • 가) LMM 관련
    • ㅇ LMM 유출에 따른 응급조치 사항을 상황별로 설명하고 표로 요약 제시
      예) 종균배양 – 접종, 시료 채취 시 LMM 유출 등, 균주 이동 – 용기파손·누출,본배양 - 설비 오작동, 배양기 파손, 작업구역 내 LMM 및 관련 폐기물 유출 등
    • ㅇ 천재지변, 화재 등 설비 파손에 의한 유출, 사람에 의한 의도적 유출 등
  • 나) 작업종사자 관련
    • ㅇ LMM을 취급하는 작업종사자와 관련된 응급조치 사항을 상황별로 설명하고 표로 요약 제시
      예) 균주접촉, 배양액 노출 사고 등
      • ∙ 작업 종료 후 또는 LMM 노출 시 신체 부위를 세척 또는 소독할 수 있는 설비 및 약품에 대한 설명
  • 다) 비상 연락망
    • ㅇ 내부 대응조직도, 비상 연락망 등에 관해 설명하고 관련 정보 제시
    • ㅇ 소방서, 병원 등 안전조치를 위하여 필요한 외부 기관 연락처 및 위치 제시

• ※ 일반적인 LMM 관리와 외부 유출 방지를 위한 기관 내 정책과 방안에 관해 설명
• 1) 보관
  • ㅇ LMM 보관 및 관리 정책과 방안을 설명하고 관련 설비 이미지 제시
    • ∙ 잠금장치, 보안시스템, 장비, 보관소 사진 등
    • ∙ 전담 인력, 보관소 출입 관리 정책에 관해 설명
    • ∙ 출입 대장 등 관련 문서의 대표 이미지를 본문에 삽입하고 해당 문서는 별첨
      • - LMM 반출·입, 사용 이력 관리 등 추적 이력 기록물
      • - 유전자변형생물체법 시행규칙 별지 제45호의2「시험·연구용 등의 유전자변형생물체 취급·관리대상」서식 참조 가능
      • - 세포은행(Cell Bank/Master stock)과 관련된 균주 유입과 반출시 날짜, 인수인계자, LMM 이름과 번호, LMM 특성, 유입/이용/반출된 LMM 바이알과 플레이트 수량, 유입/이용/반출 목적 등의 내용을 담을 수 있음
    • 
      
  • ㅇ 세포은행(Cell Bank/Master stock)이 다른 시설, 별도 장소에 보관된 경우
    • ∙ 이송 용기, 경로, 안전대책, 관련 문서 등을 구체적으로 설명하고 관련 정보 제시
      - 관련 사진 자료, 도면과 모식도 등을 제시
• 2) 표시
  • ㅇ 생산공정이용시설 내에서 LMM 표시와 관리 내용을 설명
    • ∙ 관련 사진 자료, 도면과 모식도 제시
• 3) 불활성화 및 폐기 방법
  • (실험결과 제시, 시설 미확보 시 신청단계에서는 파일럿스케일 수준과 생산시설 수준 불활성화에 차이가 없도록 운영, 관리할 것을 확약하는 문서를 제출)
  • 가) LMM 불활성화(사멸화) 방법
    • ㅇ LMM 불활성화(사멸화) 방법에 관해 설명하고 확인 자료 제시
  • 나) LMM 취급 물품, 장비(배지, 배양액, 배양기 등)별 불활성화 방법과 관리 방안을 설명
    • ㅇ PFD에 따라 seed 배양에서부터 각 발효조, 분리정제 단계 관련 장비, 저장조, 리시브 탱크, 폐액 저장조 등의 현장 사멸화 공정(Sterilization in place, Clean in place) 관련 사항을 표로 제시
      • ∙ 장비명, 용량, 재질, 취급물, 불활성화/사멸화 조건과 절차 등 요약 제시
      • 
        
  • 다) 성상별 폐기물 불활성화 방법
    • ㅇ 공정 순서에 따라 고체(고상)폐기물 불활성화 방법과 처리 절차를 설명하고 확인 자료 제시
      • ∙ 고체폐기물: LMM, 취급 기자재(LMM와 접촉하거나 접촉 가능성이 있는) 폐기법, 폐기물 처리 흐름도 제시
    • ㅇ 공정 순서에 따라 배양액·폐수 등 액상폐기물 처리법에 관해 설명하고 절차 흐름도 제시
      • ∙ LMM이 접촉된 장비의 폐수 배관도면 첨부
      • ∙ LMM이 접촉된 장비의 세척폐수가 불활성화되지 않은 채 일반폐수로 유입되지 않도록 관리 방법 제시
      • ∙ 폐수멸균시스템(Biokill tank)의 운용조건과 규모(탱크 용량, 단위 시간당 처리량 등) 제시
      • ∙ 폐수 저장조에서 LMM 불활성화/사멸화 처리 후 LMM 부정확인시험 결과 또는 이와 동등 수준의 조건을 적용한 연구 파일럿 결과 제시
        - 최대 생산 계획에 따른 폐수발생량과 폐수멸균시스템 운용조건과 규모의 적정성을 확인할 수 있는 자료와 설명 제시
      • ∙ 바이오폐수가 사업장 폐수처리시설로 유입되는 경우, 불활성화/사멸화 방법 제시
    • ㅇ 배기 시스템(Vent filter 또는 Scrubber)의 규격, 운영 방법을 설명하고, 해당 시스템의 성능검사 결과와 LMM 부정확인시험 결과 제시
    • ㅇ 폐기물 위탁 업체가 있는 경우, 절차와 운영 사항을 설명하고 계약 관련 문서의 대표 이미지를 본문에 삽입하고 해당 문서는 별첨
    • ㅇ 상기 내용과 관련한 기록물 관리와 보관과 운영에 관한 사항을 설명하고 정보 제시

• 1) 전문인력 현황
  • ㅇ 취급․관리 전문인력의 구성과 운영에 관한 사항을 설명하고 관련 정보 제시
    • ∙ 관련 위원회를 구성한 경우, 조직도 및 역할과 책임 명기
    • ∙ 유전자변형생물체법 통합고시 별지3-5호 서식의 “유전자변형생물체 관리 전담 인력 지정상황”에 따라 지정, 관리할 수 있음
  • 
    
  • ㅇ 계약·위탁생산의 경우, LMM 취급에 관한 관계와 역할, 책임 등을 설명하고 관련 정보 제시
    • ∙ 계약서 등 관련 문서의 대표 이미지를 본문에 삽입하고 해당 문서는 별첨
• 2) 교육·훈련
  • ㅇ 취급․관리 전문인력의 교육․훈련 프로그램에 관해 설명하고 관련 정보 제시
    • ∙ 대내외 교육·훈련에 관해 강사, 이수자, 운영 등에 관한 사항 등을 설명하고 관련 정보 제시
    • ∙ 수료증, 이수증 등 관련 문서가 있는 경우, 대표 이미지를 본문에 삽입하고 해당 문서는 별첨