밀폐이용 안전관리 기술정보

밀폐이용 안전관리 기술정보

공정산물

유전자변형 미생물 생산 공정 폐기 가스, 폐기물 및 폐수 모니터링

1. 실험목적
1.1 실험목적
  • - 유전자변형미생물(Living Modified Microorganisms, LMMs)의 밀폐이용시설에서의 이용 시 발생하는 폐기 가스, 공정 폐기물 및 폐수 등을 통해 발생할 수 있는 비의도적 유출을 확인할 수 있는 모니터링 방법을 제시하고자 함
  • - 이를 위하여, 카나마이신 항생제 저항성 선발표지유전자가 도입된 그람 음성균 대장균(Escherichia coli), 그람 양성균 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 그리고 진균류 효모 (Saccharomyces cerevisiae)의 밀폐이용시설에서 발생하는 공정 폐기 가스, 공정이용 후의 멸균된 균체 폐기물 그리고 배양 후 균체가 제거된 상등액 등을 대상으로 해당 항생제 내성 미생물의 모니터링 검출 여부와 PCR을 이용한 분석 등을 통해 LMM의 존재 여부를 확인할 수 있는 방법을 확립하였음
1.2 실험 배경
  • - 밀폐이용시설에서 유전자변형 미생물 생산 중 발생하는 배기 가스를 통한 살아있는 유전자변형 미생물이 대기 중으로의 비의도적 유출이 발생할 수 있음
  • - 이를 방지하기 위해 배기가스를 멤브레인 또는 멸균이 가능한 스크러버 등을 통해 미생물을 제거하여 폐기가스로 대기중으로 배출됨
  • - 또한 배양 후 분리된 균체의 경우 열처리 및 화학적 처리 등을 통한 멸균 처리 후 배출되도록 하고 있으며, 이때 발생하는 폐수에서도 살아있는 유전자변형 미생물의 비의도적 유출을 방지하도록 되어 있음
  • - 따라서 각 공정에서의 잔존 여부를 확인할 수 있는 모니터링 시스템의 개발이 필요함
  • - 유전자변형 미생물의 세포 크기가 작은 그람음성균 대장균(Escherichia coli)과 그람양성균 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)은 각각 0.4~0.7 x 1~30㎛, 0.3~0.8 × 1.0~8.0㎛의 크기로 알려져 일반적인 공기 여과 필터를 통과하기가 용이함
  • - 또한 공정이용이 끝난 유전자변형 미생물의 균체 폐기물과 균체가 제거된 폐수의 멸균 또는 균체 분리 방법에 따라서도 살아있는 유전자변형 미생물이 유출될 수 있음
  • - 따라서, 본 연구에서는 이를 방지하기 위한 다양한 방법을 통한 살아있는 유전자변형 미생물의 모니터링 방법을 제시하고자 함
2. 실험장비(도구) 및 재료
2.1 실험기자재
  • - Air Sampling Pump, Mini Pump
  • - 냉장고
  • - 미생물 항온 배양기
  • - 진탕 배양기
  • - 볼텍스믹서
  • - Thermal Cycler
  • - Micro Pipette (1-10㎕, 20-200㎕, 100㎕-1000㎕)
  • - 소형 전기영동장치(Mini Submarine Electrophoresis System)
  • - 다용도 원심분리기
  • - 고압증기멸균기
  • - 무균작업대
  • - PCR tube (0.2㎖)용 Micro centrifuge
  • - Ultraviolet (UV) Transilluminator
2.2 실험재료
  • - 0.45㎛ Pall membrane filter
  • - 0.2㎛ Nalgene® Analytical filter funnel
  • - PCR tube (200㎕)
  • - PCR tip (1-10㎕, 20-200㎕, 100㎕-1000㎕)
  • - Luria-Bertani (LB) agar (E.coli)
  • - Luria-Bertani (LB), Brain Heart Infusion (BHI) agar (C.glutamicum)
  • - Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) agar (S.cerevisiae)
  • - 미생물 배양용 멸균 Petri dish
  • - 1.5㎖ 튜브, 50㎖ conical 튜브
  • - 멸균증류수 (SDW, sterilization distilled water)
  • - Spreader
  • - 핀셋
3. 실험과정
3.1 공정 폐기 가스 수집 및 유전자변형 미생물의 검출
  • 1) 공기 샘플 채집 시기는 대장균과 코리네박테리움 글루타미쿰의 경우 대량배양을 시작한 후 4~8시간 사이, 효모의 경우는 대량배양 시작한 후 12~16시간 사이로 권장한다. 이 시점에 많은 부유 미생물이 발생하며, 이를 통해 폐기처리가 적절히 이루어지고 있는지 확인할 수 있다.
  • 2) 밀폐이용시설의 폐기가스 시료를 채취하기 위해, 폐기가스 최종 배출구에 air sampling pump(그림 1)을 이용하여 0.45 ㎛ 기공 크기의 membrane filter에 2분간 3L의 공기를 통과시킨다. 실험오차를 줄이기 위해 3반복 샘플 수집을 권장한다.
  • 3) 필터의 공기 접촉면을 유전자변형 미생물의 선발표지 유전자 해당 항생제(kanamycin 등)를 첨가한 각 미생물별 최적 고체배지에 올려놓고 유전자변형 미생물의 적절한 배양온도에서 적정 생장 시간 동안 배양한다. 단, 미생물 군집(colony)의 크기가 작은 경우 12시간 동안 추가 배양을 권장한다(그림 2).
  • 4) 항생제 저항성 균주 코로니가 발생한 경우 PCR 분석법을 이용하여 균주가 해당 유전자 변형 미생물인지 확인한다. PCR primer는 도입유전자와 주변 염기서열 부위를 포함하게 디자인한 event-specific primer를 사용할 것을 권장한다.

  • 그림 1. Air sampling pump 예시(Mini Pump, Personal Air Sampler, SIBATA, Japan)


  • 그림 2. 폐기가스 샘플 필터 배양 예시
3.2 공정 폐기물 수집 및 유전자변형 미생물의 검출
  • 1) 밀폐이용시설에서 이용된 유전자변형 미생물의 폐기처리는 일반적으로 고온 멸균 및 화학적 처리 등을 통해 진행된다. 멸균처리 후의 폐기물 20㎖를 3반복으로 채집하여 4℃에 보관한다.
  • 2) 무균작업대에 20㎖의 샘플을 1분 동안 교반한 후 100㎕의 폐기물을 유전자변형 미생물에 선발표지로 사용된 항생제(kanamycin 등)를 첨가한 각 미생물별 최적 고체배지에 3반복으로 도말하여 유전자변형 미생물의 적절한 배양온도에서 적정 생장 시간 동안 배양한다. 단, 미생물 군집(colony)의 크기가 작은 경우 12시간 동안 추가 배양을 권장한다.
  • 3) 항생제 저항성 균주 코로니가 발생한 경우 PCR 분석법을 이용하여 균주가 해당 유전자 변형 미생물인지 확인한다. PCR primer는 도입유전자와 주변 염기서열 부위를 포함하게 디자인한 event-specific primer를 사용할 것을 권장한다.
3.3 공정폐수 수집 및 유전자변형 미생물의 검출
  • 공정 폐수 처리 전후 시료를 각각 20㎖씩 3 반복을 채취하여 4℃에서 보관한다. 폐수에 살아있는 유전자변형 미생물 수 분석을 위해 다음 세가지 방법을 제시한다.
3.3.1 직접 도말법
  • 1) 이 방법은 폐수에서 미생물 함량이 높을 것으로 예측될 때 적용된다.
  • 2) 무균작업대에 20㎖의 폐수 샘플을 1분 동안 교반하여 100㎕의 폐수를 유전자변형 미생물의 선발표지 유전자 해당 항생제(kanamycin 등)를 첨가한 각 미생물별 최적 고체배지에 도말한다(3반복 수행).
  • 3) 배지를 유전자변형 미생물의 적절한 배양온도에서 적정 생장 시간 동안 배양한다. 단, 미생물 군집(colony)의 크기가 작은 경우 12시간 동안 추가 배양을 권장한다.
  • 4) 항생제 저항성 균주 코로니가 발생한 경우 PCR 분석법을 이용하여 균주가 해당 유전자 변형 미생물인지 확인한다. PCR primer는 도입유전자와 주변 염기서열 부위를 포함하게 디자인한 event-specific primer를 사용할 것을 권장한다.
3.3.2 농축 도말법
  • 1) 20㎖의 폐수를 원심분리기기를 이용하여 5,000rpm, 4℃, 30분간 원심분리한다. 상층액 18㎖를 제거하고 2㎖ 만을 남긴다(10배 농축).
  • 2) 농축된 폐수를 교반하여 균질화한 후 200㎕ 의 농축폐수를 유전자변형 미생물의 선발표지 유전자 해당 항생제(kanamycin 등)를 첨가한 각 미생물별 최적 고체배지에 도말한다(3반복 수행).
  • 3) 배지를 1시간 동안 무균작업대에 방치한다.
  • 4) 배지를 유전자변형 미생물의 적절한 배양온도에서 적정 생장 시간 동안 배양한다. 단, 미생물 군집(colony)의 크기가 작은 경우 12시간 동안 추가 배양을 권장한다.
  • 5) 항생제 저항성 균주 코로니가 발생한 경우 PCR 분석법을 이용하여 균주가 해당 유전자 변형 미생물인지 확인한다. PCR primer는 도입유전자와 주변 염기서열 부위를 포함하게 디자인한 event-specific primer를 사용할 것을 권장한다.
  • 6) 유전자 변형 미생물로 확인된 코로니의 CFU/㎖를 아래 공식으로 도출한다.

3.3.3 여과­배양법
  • 1) 무균작업대에 20㎖의 폐수 샘플을 1분 동안 vortex 한 다음에 0.2㎛ 여과지가 포함된 analytical funnel 장치를 이용해서 여과한다.
  • 2) 여과된 filter를 접촉면을 위로하여 유전자변형 미생물의 선발표지 유전자 해당 항생제(kanamycin 등)를 첨가한 각 미생물별 최적 고체배지에 올려놓고 유전자변형 미생물의 적절한 배양온도에서 적정 생장 시간 동안 배양한다. 단, 미생물 군집(colony)의 크기가 작은 경우 12시간 동안 추가 배양을 권장한다.
  • 3) 항생제 저항성 균주 코로니가 발생한 경우 PCR 분석법을 이용하여 균주가 해당 유전자 변형 미생물인지 확인한다. PCR primer는 도입유전자와 주변 염기서열 부위를 포함하게 디자인한 event-specific primer를 사용할 것을 권장한다.