산업용 유전자변형생물체 안전정보 서비스

1.1 실험목적

유전자변형 미생물의 배양 및 생산 공정 과정에서 유전자변형 미생물이 밀폐이용시설에서 외부로 유출되어 유전자변형 미생물 이용구역 내의 대기중으로 유출된 경우를 가정하여 이를 검출할 수 있는 모니터링 방법을 제시하고자 한다. 이를 위하여, 항생제 저항성 유전자가 도입된 유전자변형 미생물 이용시설 내부에서 부유, 낙하, 시설표면 등의 비의도적 유출을 검출하기 위한 검출 방법을 제시한다.

1.2 실험배경

현재, 실내 환경 중 미생물을 검출하는 방법으로는 충돌법, 자유낙하법, 표면검출법 등이 이용되고 있다. 충돌법은 세균배양용 배지가 장착된 채취기(총 부유 세균 포집기, 관성충돌기)를 이용하여 실내 공기 채취 시 공기 중 미생물이 기기에 미리 장착된 배지에 충돌하는 원리를 이용하여 실내 공기 중 총 부유 세균을 채취하고 농도를 측정하는 방법으로 상대적으로 용이한 측정 과정, 높은 채취 효율성, 시료의 적정 희석 및 배지 도말 과정을 생략하고 배양과정만 거치면 완료되는 편의성 등으로 실내 부유 세균 농도 측정 시 활용도가 높다. 자유낙하법의 경우 검출용 고체배지를 검사하고자 하는 위치에 노출시켜 실시간으로 낙하하고 있는 미생물을 검출하는 방법으로 채취하기가 매우 쉽고 시료의 적정 희석 및 배지 도말 과정을 생략하고 배양과정만 거치면 완료되어 매우 간단한 방법이다. 표면채취법은 특정 범위의 표면에서 시료를 채취해 도말하여 포집하는 방법으로 낙하균과 달리 이미 벽 표면, 장비 표면 등의 표면에 있는 미생물 등 표면에 낙하한 부유 미생물만을 채취할 수 있다.

2.1 실험기자재

- 실내공기 총 부유 세균 포집기(관성충돌기, 그림 1)
- 무균작업대
- 항온배양기
- 냉장고
- Micro Pipette (1-10㎕, 20-200㎕, 100㎕-1000㎕)
- 고압증기멸균기
그림4 관성충돌기 예시(켐익코퍼레이션 KAS-120 모델)

2.2 실험재료

- 3M pipette swab PLUS(NaCl 0.85 %)
- 유전자변형 미생물 배양 배지 (예를 들어, Luria-Bertani (LB) agar (Escherichia coli); Luria-Bertani (LB), Brain Heart Infusion (BHI) agar (Corynebacterium glutamicum); Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) agar (Saccharomyces cerevisiae))
- 유전자변형 미생물의 선발표지유전자 해당 항생제
- 지퍼백
- 파라필름
- 아이스박스
- Spreader
- 70 % 에탄올(EtOH)
- Micro Pipette tip (1-10㎕, 20-200㎕, 100㎕-1000㎕)
- 미생물 배양용 멸균 Petri dish

3.1 관성충돌법

1) 시료 채취 전, 유전자변형 미생물을 배양하고자 하는 고체배지를 제조한다. 멸균 처리된 액체 상태의 고체배지에 항생제를 넣어 항생제 배지를 만든다. 항생제의 활성도 보존을 위해 항생제 배지는 채취 전날에 만드는 걸 권장한다. 제조된 항생제 배지는 4 ℃ 냉장고에 넣어 보관한다. 이동 시 아이스박스에 넣어 4 ℃ 온도를 유지하여 항생제 활성의 저하를 막는다.
2) 항생제 배지를 관성충돌기에 장착전, 실내온도와 평형화하여 배지 내에 물기가 생기지 않게 한다.
3) 관성충돌기는 국가법령정보센터에 게시된 실내공기질 공정시험법 (참고 1)에 따라 내부 벽에서 1 m 이상, 바닥으로부터 1.5 m 위치에 설치한다.
4) 관성충돌기는 측정하고자 하는 생산 이용시설에서 1 m, 5 m 간격으로 설치한다.
5) 항생제 배지 설치 시 오염방지를 위해 사용 전, 관성충돌기 흡입구 쪽을 70 % 에탄올을 사용하여 소독한다.
6) 관성충돌기는 국가법령정보센터에 게시된 실내공기질 공정시험법에 따라 유량 250 L를 20분 간격으로 3회 포집한다. 참고로 유량 및 시간은 관성충돌기 제품에서 세팅이 가능하다.
7) 실내공기가 포집된 배지는 포집 위치, 날짜를 작성 후 파라필름 혹은 지퍼백을 사용하여 외부와 차단한 후, 아이스박스에 담아 실험실로 옮긴다.
8) 운반한 배지는 항온배양기에 넣어 사용된 유전자변형 미생물의 적정 생장온도 및 생장 시간에 맞춰서 배양한다. 단, 미생물 군집(colony)의 크기가 작은 경우 12시간 동안 추가 배양을 권장한다.
9) 항생제 저항성 균주 코로니가 발생한 경우 PCR 분석법을 이용하여 균주가 해당 유전자 변형 미생물인지 확인한다. PCR primer는 도입유전자와 주변 염기서열 부위를 포함하게 디자인한 event-specific primer를 사용할 것을 권장한다.
10) 총부유세균의 농도 계산(CFU/m3)은 다음 식에 따라 계산한다.
그림 2. 관성충돌기 설치 예시

3.2 자유낙하법

1) 시료 채취 전, 유전자변형 미생물을 배양하고자 하는 고체배지를 제조한다. 멸균 처리된 액체 상태의 고체배지에 항생제를 넣어 항생제 배지를 만든다. 항생제의 활성도 보존을 위해 항생제 배지는 채취 전날에 제조하는 것을 권장한다. 제조된 항생제 배지는 4 ℃ 냉장고에 넣어 보관한다. 이동 시 아이스박스에 넣어 4 ℃ 온도를 유지하여 항생제 활성의 저하를 막는다.
2) 식약처의 의료기기 제조 및 품질관리기준(참고2)에 따라 벽과 30 cm 이상 떨어진 바닥에서 포집한다.
3) 낙하균이 떨어질 것이라 예상되는 곳에 항생제 고체배지의 뚜껑을 열고 30분간 방치하여 포집한다. 포집 시 한 구역당 3개의 항생제 고체배지를 배치한다(그림 3)
4) 낙하균 시료 포집 시 항생제 배지 내에 오염물이 들어가지 않도록 주의한다.
5) 낙하균을 포집한 항생제 배지는 파라필름 혹은 지퍼백을 사용하여 외부와 차단한 후, 아이스박스에 넣어 실험실로 운반한다.
6) 운반한 배지는 항온배양기에 넣어 사용된 유전자변형 미생물의 적정 생장온도 및 생장 일수에 맞춰서 배양한다. 단, 미생물 군집(colony)의 크기가 작은 경우 12시간 동안 추가 배양을 권장한다.
7) 항생제 저항성 균주 코로니가 발생한 경우 PCR 분석법을 이용하여 균주가 해당 유전자 변형 미생물인지 확인한다. PCR primer는 도입유전자와 주변 염기서열 부위를 포함하게 디자인한 event-specific primer를 사용할 것을 권장한다.
그림 3. 자유낙하법 배지 설치 예시(붉은 원)

3.3 표면균

1) 시료 채취 전, 유전자변형 미생물을 배양하고자 하는 고체배지를 제조한다. 멸균처리된 액체 상태의 고체배지에 항생제를 넣어 항생제 배지를 만든다. 항생제의 활성도 보존을 위해 항생제 배지는 채취 전날에 제조하는 것을 권장한다. 제조된 항생제 배지는 4 ℃ 냉장고에 넣어 보관한다.
2) 채취하고자 하는 표면 위에 채취틀(가로 10 cm X 세로 10 cm)을 사용하여 위치를 명확하게 한다(그림 7).
3) 표면을 3M pipet swab 등을 사용하여 표면균을 채취한다. 채취 시 가로, 세로, 대각선 총 3회를 꼼꼼히 문질러 시료를 채취한다(그림 8).
4) 채취한 pipet swab을 채취 위치, 날짜, 시간을 작성하여 아이스박스에 넣어 실험실로 이동한다.
5) 운반한 시료는 무균대에서 100 ul의 샘플액을 항생제 배지에 도말한 후, 항온배양기에 넣어 사용된 유전자변형 미생물의 적정 생장온도 및 생장 일수에 맞춰서 배양한다. 단, 미생물 군집(colony)의 크기가 작은 경우 12시간 동안 추가 배양을 권장한다.
6) 항생제 저항성 균주 코로니가 발생한 경우 PCR 분석법을 이용하여 균주가 해당 유전자 변형 미생물인지 확인한다. PCR primer는 도입유전자와 주변 염기서열 부위를 포함하게 디자인한 event-specific primer를 사용할 것을 권장한다.
그림 7. 표면검사용 채취틀 예시
그림 8. 샘플링 방법 예시
그림 9. 바닥 및 배양기 표면균 샘플링 예시

1) 측정이 오차를 줄이기 위해 측정 위치 주변에 최대한 사람의 활동이 없는 상태에서 샘플링한다.

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